Volba metod a jejich konkrétních provedení pro diagnostiku TSE je na mezinárodní úrovni kodifikována Příručkou diagnostických testů a vakcín pro suchozemská zvířata Světové organizace pro zdraví zvířat (OIE), konkrétně jejími kapitolami 2.4.5 (bovinní spongiformní encefalopatie) a 2.7.12 (scrapie). V Evropské unii se pak na úrovni legislativy odráží v příloze X nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 999/2001 ze dne 22. května 2001 o stanovení pravidel pro prevenci, tlumení a eradikaci některých přenosných spongiformních encefalopatií (dále jen „TSE nařízení“). Další informace lze nalézt na webu Referenční laboratoře EU pro TSE (TSE EURL), z jejíchž poznatků a doporučení výše uvedené dokumenty vycházejí.

Testování skotu

Pro testování BSE v rámci ročních programů sledování TSE tzv. „rychlými testy“ (základní zjišťování) používá laboratoř TSE komerčních testovacích souprav, které jsou v Evropské unii k tomuto použití validovány, schváleny, a uvedeny v příloze X, kapitole C, bodu 4 TSE nařízení. V minulosti používala laboratoř TSE v různých obdobích sedm z celkem třinácti v příloze X TSE nařízení uvedených testů. V současnosti je k testování skotu na BSE v EU schváleno šest komerčních testovacích souprav, z nichž k tomuto účelu používáme dvě:

• imunotest využívající chemický polymer k selektivnímu záchytu PrP^Sc a monoklonální detekční protilátku proti konzervovaným regionům molekuly PrP (IDEXX HerdChek BSE-Scrapie Antigen Test Kit, EIA), a
• imunochromatografický test využívající dvě různé monoklonální protilátky k detekci frakcí PrP odolných proteináze K (Prionics-Check PrioSTRIP).

K následným zkouškám vzorků s pozitivními výsledky získanými rychlými testy používáme komerční diagnostickou soupravu Bio-Rad TeSeE Western Blot využívající principu digesce PrP proteinázou K (PK) a detekce a částečné typizace PK-rezistentních fragmentů sendvičem monoklonální protilátky specifické pro PrP a konjugátu monoklonální detekční protilátky s chemiluminiscenční koncovkou. Pro účely diagnózy BSE u skotu je zkouška metodou Western Blot v kombinaci s dalším rychlým testem na jiném principu odlišným od rychlého testu použitého při základním zjišťování a za použití odpovídajících kontrolních vzorků při tomto druhém rychlém testu nyní OIE schválena (a následně v příloze X, kapitole C, bodu 3.1 b) TSE nařízení uvedena) jako konfirmační (potvrzující) test. U nás je však konfirmační vyšetření BSE skotu prováděno, shodně jako potvrzující vyšetření TSE malých přežvýkavců, oddělením patologie (viz níže).

Další vyšetřování pozitivních případů BSE povinné od roku 2013 (diskriminační testování C-BSE / H-BSE / L-BSE) podle přílohy X, kapitoly C, bodu 3.1 c) TSE nařízení v naší laboratoři neprovádíme. V případě potvrzení dalšího případu BSE by bylo provedeno formou subdodávky jednou z laboratoří k tomuto testování schválenou EURL, nebo EURL samotnou.

Testování malých přežvýkavců

Pro testování TSE malých přežvýkavců v rámci ročních programů sledování TSE tzv. „rychlými testy“ (základní zjišťování) používáme jeden z testů, jež jsou k tomuto účelu v EU validovány, schváleny, a uvedeny v příloze X, kapitole C, bodu 4 TSE nařízení, a to:

• imunotest využívající chemický polymer k selektivnímu záchytu PrP^Sc a monoklonální detekční protilátku proti konzervovaným regionům molekuly PrP (IDEXX HerdChek BSE-Scrapie Antigen Test Kit, EIA).

Konfirmační vyšetření vzorků s pozitivními výsledky získanými rychlými testy provádí oddělení patologie (viz níže).

U potvrzených případů TSE malých přežvýkavců provádíme primární molekulární testování metodou Western Blot podle přílohy X, kapitoly C, bodu 3.2 c) i) TSE nařízení. K tomu používáme metodu „The AHVLA Bio-Rad TeSeE-based Hybrid Western blotting Method“ podle příručky EURL „TSE Strain Characterisation in Small Ruminants“. Cílem tohoto vyšetření (povinného v EU od roku 2005) je rozlišení mezi případem klasické scrapie a možným případem BSE u malých přežvýkavců, jenž by pak byl podroben tzv. „sekundárnímu molekulárnímu testování dalšími metodami“ v EURL a dalších laboratořích v tomto bodu TSE nařízení uvedených. Při tomto primárním molekulárním vyšetření dále spolehlivě diferencujeme mezi klasickou a atypickou (NOR98) scrapie, což rychlý test neumožňuje, a ačkoliv je možno tuto diferenciaci provést při konfirmačním vyšetření metodou imunohistochemie prováděném oddělením patologie, stav dodaných vzorků (částečný rozklad tkáně CNS u uhynulých zvířat) ji zde často znemožňuje.

Volba testovací metody

Volbu testovací metody si laboratoř TSE vyhrazuje podle svých potřeb, povahy a stavu vzorků, pokud neexistuje specifický požadavek zákazníka na použití konkrétní testovací metody. U vyšetření vzorků mimo ročních programů sledování TSE, zvláště pak u matric jiných než nervová tkáň prodloužené míchy přežvýkavců, je použitá testovací metoda dohodnuta se zákazníkem a je volena podle vhodnosti pro daný účel. U těchto matric je zpravidla nutno provést validaci vybrané metody pro testovanou matrici a analyt.

Oddělení patologie provádí odběr vzorku prodloužené míchy k provedení rychlých a případných konfirmačních testů v případě doručení celé hlavy – především u zvířat podezřelých z nákazy TSE (odběr orgánů a tkání bez pitvy), a v případě pozitivního výsledku rychlého testu prováděného laboratoří TSE (u podezřelých zvířat bez ohledu na výsledek rychlého testu a jako součást diferenciální diagnostiky případných dalších onemocnění nervového systému) pak konfirmační vyšetření metodami histopatologie, a především imunohistochemie, podle metodiky EURL. Další informace o diagnostických metodách používaných oddělením patologie se můžete dovědět zde.

Laboratoř molekulární biologie provádí determinaci polymorfismu kodonů 136, 141, 154 a 171 PrP genu u ovcí (PRNP genotypizaci) metodami real-time PCR, a případně PCR-SSCP. V případě nutnosti dourčení haplotypů nebo při výskytu vzácných polymorfismů v blízkosti uvedených kodonů je genotyp zjišťován metodou přímé sekvenace DNA.

Určení parentity ovcí a skotu je prováděno determinací genotypu mikrosatelitních markerů fragmentační analýzou DNA a jeho porovnáváním s genotypy dodaných nebo dříve vyšetřených vzorků uvedených (potenciálních) rodičů.

Další informace o diagnostických metodách používaných naší laboratoří molekulární biologie se můžete dovědět zde.

Všechny zkoušky prováděné v oblasti TSE jsou akreditovány ČIA podle ČSN EN ISO/IEC 17025:2005.