Diagnostické metody používané na oddělení virologie a sérologie

ELISA Ab
Imunoenzymatická reakce k průkazu specifických protilátek. Antigen je navázaný v jamkách mikrotitračních destiček. Protilátky ze vzorku séra navázané na antigen jsou detekovány konjugátem, který reaguje se substrátem a dochází ke změně zabarvení. Intenzita zabarvení se měří spektrofotometricky.

ELISA Ag
Imunoenzymatická reakce k průkazu antigenu. Antigen se váže na specifickou protilátku navázanou v jamkách mikrotitračních destiček. Na antigen se váže přidaná detekční protilátka specifická pro daný antigen. Vzniklý komplex je detekován konjugátem, který reaguje se substrátem a dochází ke změně zbarvení. Intenzita zabarvení se měří spektrofotometricky.

Hemaglutinačně-inhibiční test (HIT)
Stanovuje kvantitativně přítomnost hemaglutinačně-inhibičních protilátek proti virovému antigenu ve vyšetřovaném vzorku. Přítomnost protilátek je indikována inhibicí aglutinace a sedimentací erytrocytů.

IF test (přímý imunofluorescenční test)
Antigen přítomný v infikovaných tkáních reaguje se specifickými protilátkami značenými FITC. Ve fluorescenčním mikroskopu je pozorovatelná charakteristická fluorescence cytoplazmy buněk.

Imunodifuzní test (IDT)
Precipitace v agarovém gelu. Precipitační linie vzniká v místě styku antigenu a protilátky difundujících proti sobě v gelu.

Imunoelektroforéza v agar-gelu
Elektroforetická separace následovaná imunoprecipitací rozdělených proteinů specifickými protilátkami, většinou v prostředí agarózy.

Imunochromatografický test (ICHT)
Imunoenzymatický test, který stanovuje kvalitativně přítomnost viru. Systém využívá nitrocelulózové membrány se specifickými monoklonálními protilátkami proti viru, které jsou konjugovány s koloidním zlatem. Když je imunochromatografický proužek ponořen do suspenze vzorku, migruje kapilárně vzorek i protilátky konjugované s koloidním zlatem (konjugát). V přítomnosti viru vzniká komplex antigen–konjugát–monoklonální protilátka vizualizovaný v podobě pozitivní linie na detekčním proužku.

IPMA – Immunoperoxidase Monolayer Assay
Imunoperoxidázový test, který stanovuje kvantitativně přítomnost protilátek ve vyšetřovaném séru proti virovému antigenu, který je fixován v buněčné kultuře v jamkách mikrotitračních destiček. Přítomnost protilátek je indikována tvorbou hnědočerveného zabarvení v cytoplazmě buněk. Intenzita zabarvení v různých ředěních séra odpovídá množství přítomných protilátek. Výsledek je udáván v „titrech“.

Izolace viru
Izolace viru na buněčných kulturách a jeho následná identifikace imunoperoxidázovým testem nebo metodami molekulární biologie (PCR, RT-PCR, …). Virus (např. BVD) přítomný v biologickém materiálu (orgány, tělní tekutiny, sekrety a exkrety, leukocyty periferní krve) je schopen se pomnožovat na vnímavých tkáňových kulturách in vitro bez tvorby cytopatického efektu (CPE) – necytopatogenní kmeny (ncp), nebo s tvorbou charakteristického CPE – cytopatogenní kmeny (cp). Virus je nutno ve tkáních dále identifikovat IF testem nebo imunoperoxidázovým testem s použitím skupinově nebo druhově specifických monoklonálních protilátek.

Neutralizační imunoperoxidázový test (NPLA)
Mikrotitrační neutralizační imunoperoxidázový test stanovuje kvantitativně přítomnost protilátek proti viru testováním postupných dvojnásobných ředění vyšetřovaného séra proti standardnímu ředění virové suspenze obsahujícím 100 TCID₅₀ na vnímavých tkáňových kulturách. Nezneutralizovaný virus se detekuje ve tkáních PLA testem.

NIF (nepřímý imunofluorescenční test) – Indirect Immunofluorescence Antibody Test (IFAT)
Test na kvalitativní i kvantitativní průkaz specifických protilátek. V tomto testu jsou vzorky sér inkubovány s antigenem (virem) fixovanými na mikroskopických podložních sklech. Ve druhém kroku jsou přidávány fluoresceinem značené protilátky proti imunoglobulinům daného vyšetřovaného zvířete. Metoda je založena na skutečnosti, že některé chemické látky (fluorochromy) po dopadu světla o kratší vlnové délce září světlem o delší vlnové délce – tedy světlem jiné barvy. Tento jev se nazývá fluorescence. Je projevem intramolekulární energetické změny vzbuzené v látce absorbovaným zářením. Reakce se hodnotí ve fluorescenčním mikroskopu. Výsledek vyšetření různého ředění séra se udává v „titrech“.

PCR (polymerázová řetězová reakce) – Polymerase Chain Reaction
Biochemická reakce, která využívá enzym DNA-polymerázu ke kopírování DNA. Amplifikace (zmnožení) DNA pomocí PCR je zajištěno použitím dvou primerů, které nasedají na komplementární sekvence ve dvou templátových vláknech. Templátová vlákna vznikají denaturací původně dvouvláknové DNA. Primery na tato vlákna nasedají v protisměrné orientaci, tímto vznikne ohraničení žádaného amplikonu (PCR produktu) o určité délce nukleotidové sekvence např. cílového genu. Metoda PCR je využívána v různých modifikacích jako je RT-PCR, Real-time PCR, PCR-SSCP, PCR ELISA, PCR-multiplex, PCR-RFLP, atd.

PCR-SSCP
viz PCR

PCR ELISA
viz PCR

PCR-multiplex (ID)
viz PCR

PCR-RFLP
viz PCR

PLA test – Peroxidase Labelled Antibody Assay
Detekuje přítomnost viru izolovaného v monolayeru buněčné kultury imunoperoxidázovým testem pomocí specifických monoklonálních protilátek a konjugátu (protilátek značených peroxidázou). Přítomnost hnědočerveného zbarvení v cytoplazmě buněk vyskytujících se menších ložiscích nebo difúzně v celém monolayeru indikuje přítomnost viru.

Pomalá aglutinační reakce (PA)
Spočívá ve specifické reakci antigenu s protilátkou, kdy dochází k tvorbě aglutinátu. Metoda je určena ke kvantitativnímu průkazu protilátek.

Reakce vazby komplementu (RVK)
Metoda, která využívá schopnosti komplementu vázat se na komplex antigenu s protilátkou. Ke zviditelnění reakce se používá hemolytický systém. Pozitivní reakce = nepřítomnost hemolýzy, komplement není k dispozici pro hemolytický systém. Negativní reakce = přítomnost hemolýzy, komplement reaguje s hemolytickým systémem a dochází k hemolýze.

Real-time PCR (qPCR)
Moderní technika molekulární biologie umožňující rychlou, citlivou a spolehlivou detekci a kvantifikaci specifického úseku DNA nebo RNA. Stala se tak proto neocenitelným nástrojem pro detekci specifických mikroorganismů a kvantifikaci genové exprese. Je to metoda založená na principu klasické PCR, umožňuje však kvantifikaci sledovaného úseku DNA. Na rozdíl od běžné PCR, kde se analyzuje až výsledný produkt (amplifikovaná DNA) pomocí elektroforézy v agaróze, je při Real-time PCR zaznamenáván každý cyklus PCR ve skutečném čase. Záznam amplifikace je založen na principu fluorescence, kdy se používají sondy (fluorescenční látky), které se váží specificky nebo nespecificky na amplifikované DNA.

Rose bengal test (RBT)
Rychlá aglutinační reakce, která spočívá ve specifické reakci antigenu s protilátkou, kdy dochází k tvorbě aglutinátu. Antigen je barven bengálskou červení v kyselém pufru. Metoda je určena ke kvalitativnímu průkazu protilátek.

RT-PCR = polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí
Laboratorní technika pro amplifikaci určitého segmentu molekuly RNA. Její řetězec je nejprve (reverzně) celý přepsán do komplementární DNA a poté následuje amplifikace specifické DNA pomocí PCR. Tyto 2 kroky se dají dělat postupně nebo dohromady.

Rychlá aglutinační reakce (RA)
Spočívá ve specifické reakci antigenu s protilátkou, kdy dochází k tvorbě aglutinátu. Metoda je určena ke kvalitativnímu průkazu protilátek.

Virus neutralizační test (VNT)
Stanovuje kvantitativně přítomnost protilátek proti virovému antigenu testováním postupných dvojnásobných ředění vyšetřovaného séra proti standardnímu ředění virové suspenze na vnímavých tkáňových kulturách. Tvorba cytopatického efektu indikuje nepřítomnost neutralizačních protilátek v příslušném ředění séra.

Western Blot (WB) = Enzyme-linked Immunoelectrotransfer Blot Technique = immunoblot
Dvoustupňová imunochemická diagnostická technika na bázi elektroforézy a enzymatické reakce s chemiluminiscenční koncovkou na PVDF membráně. Využívá se k detekci specifických protilátek nebo antigenu (proteinu).